Cytoplazmatyczne G-kwadrupleksy RNA w chorobie Alzheimera: Badania z wykorzystaniem neuronów wyprowadzonych z ludzkich indukowalnych komórek macierzystych (hiPSCs).

Choroba Alzheimera (AD) to postępujące schorzenie neurodegeneracyjne charakteryzujące się pogorszeniem funkcji poznawczych, utratą pamięci oraz różnymi objawami neuropsychiatrycznymi i behawioralnymi. Jej patogeneza jest silnie związana z nieprawidłową agregacją białek – najbardziej widoczną cechą patologiczną AD – jednak mechanizmy leżące u jej podstaw Choroba Alzheimera (AD) to postępujące schorzenie neurodegeneracyjne charakteryzujące się pogorszeniem funkcji poznawczych, utratą pamięci oraz różnymi objawami neuropsychiatrycznymi i behawioralnymi. Jej patogeneza jest silnie związana z nieprawidłową agregacją białek – najbardziej widoczną cechą patologiczną AD – jednak mechanizmy leżące u jej podstaw pozostają nieuchwytne. Ostatnio niekanoniczne struktury DNA/RNA, znane jako G-kwadrupleksy (G4), przyciągają coraz większą uwagę ze względu na ich potencjalną rolę w inicjowaniu i rozprzestrzenianiu się chorób neurodegeneracyjnych. Coraz więcej dowodów sugeruje, że struktury G4 są integralną częścią funkcji komórkowych, regulując istotne procesy, takie jak replikacja, ekspresja genów, translacja i utrzymanie telomerów. Gdy nie są prawidłowo rozdzielane przez specyficzne heli
Celem mojej pracy jest wypełnienie tej luki i pogłębienie naszej wiedzy na temat szlaków molekularnych, które napędzają neurodegenerację w chorobie Alzheimera. Wszystkie eksperymenty zostaną przeprowadzone in vitro z wykorzystaniem neuronów różnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (hiPSC). Przygotowałem gotowe do użycia neuronalne komórki macierzyste pochodzące z hiPSC, które zostaną wykorzystane do dalszego różnicowania w dojrzałe neurony. Mój zoptymalizowany protokół różnicowania i dojrzewania neuronów zapewnia spójność i powtarzalność w moim systemie modelowym. Cel 1. Zbadanie, czy stabilizacja kwadrupleksów RNA G indukuje neurotoksyczność neuronów pochodzących z hiPSC. Według mojej najlepszej wiedzy, cPDS nie był jeszcze testowany na neuronach, dlatego jego wpływ wymaga dokładnej oceny. Będę eksperymentował z różnymi stężeniami cPDS (1, 5 i 10 μM) i czasami stymulacji (od 24 godzin do 7 dni). Następnie ocenię związek, analizując: i) Neurotoksyczność – stosując testy fluorescencyjne do analizy morfologii neuronów (poprzez barwienie MAP2 i/lub NeuO) oraz apoptozę/martwicę (za pomocą barwienia 7-AAD i kalceiną); ii) Stabilizację G4 w cytoplazmie – wizualizując te struktury za pomocą swoistych przeciwciał lub sond N-TASQ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnej lub konfokalnej. Wykorzystam również obróbkę DNAzą i RNazą jako kontrole, aby potwierdzić swoistość RNA. Cel 2. Zweryfikowanie, czy cPDS prowadzi do akumulacji agregatów białkowych związanych z AD. Na podstawie wyników z Celu 1, wybiorę optymalne stężenie i czas trwania stymulacji, które indukują akumulację G4 w cytoplazmie. Następnie ocenię: i) obecność zewnątrzkomórkowych
i wewnątrzkomórkowych złogów Aβ za pomocą immunocytochemii lub testu ELISA; ii) hiperfosforylacja tau z użyciem przeciwciał fosfo-tau do testu immunocytochemicznego. Cel 3. Określenie, czy RNAG4 stabilizowane cPDS akumuluje się w granulkach stresu i ocena, czy współistniejący stres oksydacyjny nasila akumulację G4 w cytoplazmie. Wybiorę optymalne stężenie cPDS i czas trwania stymulacji, które indukują cytoplazmatyczną akumulację G4. Aby zbadać kolokalizację, komórki zostaną współbarwione swoistymi przeciwciałami przeciwko G4 i G3BP1 (dobrze znanym markerem granulek stresu). Równocześnie, stres oksydacyjny zostanie wywołany przy użyciu subletalnego stężenia nadtlenku wodoru (H₂O₂), aby zapobiec nadmiernemu uszkodzeniu komórek. Obecność i rozmieszczenie granulek G4 i stresu zostaną przeanalizowane za pomocą mikroskopii skaningowej laserowej, a następnie skwantyfikowane w celu oceny wpływu stresu oksydacyjnego na akumulację RNA-G4.Choroba Alzheimera (AD) to postępujące schorzenie neurodegeneracyjne, które dotyka miliony ludzi na całym świecie i charakteryzuje się pogorszeniem funkcji poznawczych, utratą pamięci i zmianami w zachowaniu. Etiologia AD pozostaje niejasna i nie ma wiarygodnych markerów diagnostycznych pozwalających na identyfikację choroby we wczesnych stadiach, ani metod leczenia, które mogłyby zapobiec postępowi neurodegeneracji. Na poziomie molekularnym, AD jest napędzana przez nieprawidłowe przetwarzanie białka prekursorowego amyloidu i hiperfosforylację tau, co prowadzi do tworzenia toksycznych agregatów beta-amyloidu i splątków neurofibrylarnych, które zakłócają komunikację neuronalną i powodują śmierć komórek. Zapalenie nerwów i stres oksydacyjny dodatkowo przyczyniają się do uszkodzeń neuronów, choć leżące u ich podstaw mechanizmy pozostają niejasne [1]. Ostatnio G-kwadrupleksy (G4) – niekanoniczne struktury DNA/RNA – pojawiły się jako potencjalni uczestnicy neurodegeneracji. Jednak w jaki sposób struktury G4 wpływają na funkcje komórek mózgowych i przyczyniają się do fenotypów neurodegeneracyjnych, pozostaje nieuchwytne [2]. Kontynuując prezentowany projekt, planuję w przyszłych badaniach zbadać, czy DNA-G4 (które może indukować uszkodzenia DNA, zmieniać ekspresję genów i wpływać na kondensację chromatyny) lub RNAG4 (które może zaburzać ekspresję genów, promować tworzenie granulek stresu i wpływać na agregację białek) odgrywają kluczową rolę w postępie choroby Alzheimera. Mój model będzie obejmował neurony i komórki glejowe wyróżnione z ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących zarówno od zdrowych dawców, jak i pacjentów z chorobą Alzheimera – system, w którym posiadam doświadczenie. Uznając, że stabilizacja G4 jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do choroby Alzheimera, planuję zweryfikować jej efekty w modelach stresu oksydacyjnego, leczenia beta-amyloidem (w celu promowania tworzenia blaszek), ekspozycji na kwas okadaikowy (w celu wywołania hiperfosforylacji tau) oraz warunków niedotlenienia. Skoncentruję się na kilku kluczowych mechanizmach leżących u podstaw rozwoju choroby.